Kit de PCR en tempo real de Monkeypox Virus

1. MostraColección:A mostra debe recollerse en tubos estériles de acordo

con especificacións técnicas estándar.

2. Preparación de reactivos (Área de preparación de reactivos)

Saca os compoñentes do kit, equilibralos a temperatura ambiente para o seu uso en espera.

3. Procesamento de mostras (Área de procesamento de mostras)

3.1 Extracción de ácidos nucleicos

Recoméndase tomar mostras líquidas de 200μL, Control Positivo e Control Negativo para a extracción de ácidos nucleicos, segundo os requisitos e procedementos correspondentes dos kits de extracción de ADN viral.

3.2 Disolución de po liofilizado e adición de plantillas

Prepare a premestura liofilizada de Monkeypox Virus segundo o número de mostras.Unha mostra necesita un tubo de PCR que conteña po premestura liofilizada.O control negativo e o control positivo deben tratarse como dúas mostras.

(1) Engade 15 μl de solución de disolución a cada tubo de PCR que conteña a premestura liofilizada, despois engade 5 μl de mostras extraídas/control negativo/control positivo a cada tubo de PCR respectivamente.

(2) Cubra ben os tubos de PCR, toque os tubos de PCR coa man ata que o po liofilizado estea completamente disolto e mesturado, recolle o líquido no fondo dos tubos de PCR mediante centrifugación instantánea a baixa velocidade.

(3) Se usa un instrumento común de PCR en tempo real para a detección, transfire directamente os tubos de PCR á área de amplificación;se usa BTK-8 para a detección, entón debe realizar as seguintes operacións: transferir 10 μL de líquido do tubo de PCR ao pozo do chip de reacción do BTK-8.Un tubo de PCR corresponde a un pozo do chip.Durante a operación de pipeteo, asegúrese de que a pipeta estea a 90 graos vertical.As puntas da pipeta con barreira de aerosol deben colocarse no centro do pozo con forza moderada e deixar de empurrar a pipeta cando chegue á primeira marcha (para evitar burbullas).Despois de que se enchen os pozos, saque unha membrana de chip de reacción para cubrir todos os pozos e despois transfírese o chip á área de detección de amplificación.

4. Amplificación por PCR (área de detección)

4.1 Coloque os tubos de PCR/chip de reacción no tanque de reacción e estableza os nomes de cada pocillo de reacción na orde correspondente.

4.2 Configuración da fluorescencia de detección: (1) Monkeypox virus (FAM);(2) Control interno (CY5).

4.3 Executa o seguinte protocolo de ciclismo

Protocolo de ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protocolo de BTK-8:

5. Análise de resultados (consulte o Manual do usuario do instrumento)

Despois da reacción, os resultados gardaranse automaticamente.Fai clic en "Analizar" para analizar e o instrumento interpretará automaticamente os valores Ct de cada mostra na columna de resultados.Os resultados do control negativo e positivo axustaranse ao seguinte "6. Control de calidade".

6. Control de calidade

6.1 Control negativo: sen Ct ou Ct>40 na canle FAM, Ct≤40 na canle CY5 con curva de amplificación normal.

6.2 Control positivo: Ct≤35 na canle FAM con curva de amplificación normal, Ct≤40 na canle CY5 con curva de amplificación normal.

6.3 O resultado é válido se se cumpren todos os criterios anteriores.En caso contrario, o resultado non é válido.

Interpretación de resultados

Son posibles os seguintes resultados:

NOTA: Se se produce un resultado non válido, a mostra debe ser recollida e probada de novo.